实验动物安乐死指南

实验动物安乐死指南

Guidelines for euthanasia of laboratory animals

1. 目的(Purpose)

随着生物医学的快速发展，实验动物在各个学科各个领域的应用日益广泛，每年都有数以千万计的实验动物被用于科学研究，而人们对实验动物福利的关注也日益提升。我国科技部于2006年发布了《关于善待实验动物的指导性意见》，是我国第一部规范实验动物福利的全面系统的法规，对我国国内实验动物繁育、生产、运输、实验提出了善待实验动物的要求。安乐死是实验动物的关键性福利，也是动物实验中伦理审查的重点。随着人们动物保护意识的增强和国家实验动物福利伦理标准颁布和实施，实验动物安乐死的规范问题也越来越受到广泛关注。

苏州大学作为国家211工程首批入选高校，教育部和江苏省政府共建的“双一流”建设高校，每年都有大量的科研课题，需要使用大量的实验动物，而苏州大学实验动物中心现有实验动物实施面积数千平方米，实验动物数十万个。作为从事实验动物行业的专业人员，在夺走实验动物的生命时，我们应确保给予实验动物最高程度的尊重，尽可能使得实验动物死亡时无疼痛和无痛苦。我们使用的安乐死技术应该能够迅速导致实验动物丧失意识，随后心跳和呼吸停止，最终导致大脑功能丧失，并应尽量减少动物在失去意识之前所经历的痛苦和焦虑，确保动物在安乐死期间的痛苦最小化。在任何情况下，选择最合适的安乐死方法取决于所涉及的动物种类、可以使用的动物安乐死手段、人员技能、动物数量和其他考虑因素。

2. 安乐死定义（Definition）

安乐死（euthanasia）一词源于希腊语，“eu”的意思是好的，“thanatos”的意思是死亡，安乐死指的是“好的死亡”或“平安和有意义的死亡”，也翻译为“无痛苦致死术”。实验动物的安乐死是指用公认的、人道的方式处死实验动物的过程，使得实验动物能够没有惊恐或焦虑，能够平静地、没有痛苦地死亡。安乐死方法的最重要的标准是：安乐死应具有保证实验动物中枢神经系统立即达到死去痛觉的早期抑制作用。在这些准则的背景下，实验动物安乐死是诱导实验动物人道死亡的行为。

3. 适用范围（Scope）

1) 活体动物实验结束时(实验终点)

用实验动物进行的科学实验种类非常繁多，目的也各不相同，但相同的是，在活体动物实验结束时，都需要对实验动物实施安乐死。

2) 人道终点

在动物实验中，不可避免的会对动物造成痛苦或伤害，当动物的痛苦程度超过伦理审批的预期时，根据动物福利和动物保护的原则，应采取恰当的方法对动物进行安乐死，确保将实验动物的痛苦降到最低。

当动物实验已经失败，继续实验已经无法得到有意义的结果时，为尽早终止实验动物的痛苦，同样应实施人道终点，尽快安乐死动物。

3) 其他不适合继续饲养的原因

在动物实验中，出于饲养成本和空间等因素的考虑，经常需要对一些不适合进行实验的动物进行淘汰，如动物因为性别、年龄、体重、基因型等原因需要淘汰，此时也需对淘汰动物实施安乐死。

4. 安乐死评估标准（Standard）

在评估安乐死方法时，我们采用以下标准：

1）必须确保操作人员的安全，在使用挥发性麻醉剂（如乙醚、安氟醚、三氟乙烷）时，必须远离火源；

2） 必须接受伦理委员会的监管；

3）尽可能在不引起疼痛、痛苦、焦虑或恐惧的情况下诱发实验动物的意识丧失和死亡；

4）诱发实验动物意识丧失所需的时间要尽可能短；

5）选择的安乐死方法须安全、可靠，尽量选择容易操作的安乐死方法；

6）实验动物的死亡过程不可逆转；

7）选择的安乐死方法能够兼顾实验目的，以及兼顾随后的组织评估、检查或使用；

8）实施安乐死时，最好是在实验动物熟悉和安全的环境中，操作须温和、小心，镇静和/或麻醉是实施安乐死的最佳条件；

9）所用安乐死方法要兼顾实验动物的物种、年龄和健康状况；

10）受惊吓的动物发出痛苦的声音、恐惧的行为和释放某些气味或信息素可能会引起其他动物的焦虑和恐惧，因此，禁止在同类或者其他动物面前实施安乐死；

11）所使用的安乐死药物合法、安全、可靠、易得并且有使用权限；

12）所用安乐死方法需要仪器设备辅助的，需保持设备能正常工作运转；

13）必须在安乐死后和处置动物之前核实死亡情况，判定动物是否死亡，不仅要观察实验动物呼吸是否停止，还要观察神经反射、肌肉松弛等状况；

14）必须关注实验动物安乐死对于观察人员和操作人员的情绪影响。

5. 安乐死方法（Method）

总体来说，安乐死的方法有三大类：吸入性药物法 （二氧化碳、氮气、一氧化碳、乙醚等）；注射药物法（静脉、腹腔等注射药物）；物理方法（颈椎脱臼、断头、放血等）。

1）吸入药物法

吸入药物法主要包括吸入二氧化碳、氮气、一氧化碳、乙醚等吸入性麻醉剂。处死实验啮齿动物最常用的是二氧化碳法，将实验动物放置在二氧化碳麻醉箱中，二氧化碳会从环境中进入肺泡，然后通过血液进入实验动物大脑，当大脑中二氧化碳含量到达一定浓度，会导致意识丧失继而死亡。二氧化碳吸入法简单、安全、有效、廉价、不污染组织和环境。但要注意的是由于二氧化碳与水发生反应，在湿润组织中生成酸而对动物产生刺痛的感觉，使动物在丧失意志前感受到痛苦。建议每分钟填充30％-70%麻醉箱体积的二氧化碳。

卤代类吸入麻醉剂如异氟醚、七氟醚、氟烷等也可以用作实验室的啮齿类动物的麻醉剂，可以作为二氧化碳的替代方案。缺点是当实验动物暴露于致死剂量的麻醉剂时，许多动物会表现出厌恶和应激行为，并且当实验动物进入吸入性麻醉剂容器中，由于麻醉剂量被容器设置成亚致死浓度，安乐死的过程非常缓慢；在执行安乐死的过程中，为增加容器内麻醉剂的浓度，有时会在容器内放入被麻醉剂浸泡过的纱布，刺激性的液体可能会直接接触动物。有些动物对高浓度的卤代类吸入麻醉剂虽然有一些厌恶，但是不会像应用高浓度二氧化碳那样诱发疼痛。但需要注意的是，这些挥发性麻醉剂是环境污染物，与二氧化碳相比毒性更大。

2） 注射药物法

通过注射过量的药物，使动物迅速死亡，是非常可靠的动物安乐死方法。 注射性麻醉剂有多种给药方式，静脉注射是最佳选择。目前在药物选择中，应用过量的巴比妥类及其衍生物的药物是对动物执行安乐死的优选方法，适宜的动物种类包括啮齿类动物、兔、犬、猫、非人灵长类动物、猪、牛、马、 两栖动物、爬行动物、家禽等，应用范围较广。巴比妥类药物会导致意识快速丧失继而呼吸停止，但有些个体注射时会诱发持续的兴奋期继而丧失意识。由于小动物（如大鼠、小鼠等）静脉注射比较困难，通常会采用腹腔注射巴比妥。但腹腔注射巴比妥会因其碱性而导致动物腹部扭曲造成疼痛，因此可以在麻醉剂中加入局麻药（利多卡因）缓解因巴比妥注射而引发的伤害。 对于大动物，较为公认的最好的方法是：首先给予安定剂，待动物进入安静状态时，再行静脉注射过量的巴比妥酸盐，该法可最大限度地减少动物的紧张和挣扎。注射巴比妥药物的优点在于可以平稳的诱导并麻醉动物，因为其效果依剂量、浓度和投药方式而不同，可使动物的不适反应降到最低，失败的可能性低于物理方法，可以保留完整的身体结构。注射巴比妥类药物的缺点在于此类药品是管制类药物，需要满足对于获取、存储、使用及记录相关药品的要求。但使用巴比妥类也会引起一些动物福利问题，包括抓取动物进行注射而导致的应激；在血管周围注射溶液后潜在的疼痛；剂量没有掌控好，没有进行死亡的验证，有潜在苏醒的可能。这种安乐死方法需要采用辅助的方法确认动物是否死亡；需要对人员开展准确实施腹腔注射或静脉注射的相关培训。

3）物理方法

物理的安乐死方法主要有颈椎脱位、断头、放血、微波刺激等，物理法只要在良好的技巧及适当的工具的配合下，能迅速使动物解除疼痛达到死亡。但是未受过训练的人员去实施物理性方法时，不仅容易造成人员受伤，更可能使动物因未完全死亡而造成极大的痛苦。有些方法，如放血、脑脊髓穿刺等，不建议作为动物安乐死的单一方法，配合其他方法使用较好。对于一些小动物（如啮齿动物、禽类、仔兔、鸟 类）断头和颈椎脱位被认定为是可接受的方法，但其关键在于操作者的技能，因此建议可以配合吸入麻醉使用。为保证动物福利，实施物理性安乐死方法需要对操作人员进行系统的培训。 相对而言，断头不是理想的方法，但由于爬行动物和两栖动物的中枢系统对脑缺氧相对不敏感，因此深度麻醉后断头是它们执行安乐死的一种选择，如对此类动物进行安乐死，应先进行镇静，目的是迅速抑制维持意识的脑中枢，减少动物痛苦。 目前，国际上可以接受的专业物理方法包括专门微波设备及低温设备。对于斑马鱼，可将其快速浸入冰水中造成低体温，迅速引发冷休克；对于新生啮齿类动物，推荐缓慢冷却并在动物运动丧失后采取后续步骤确认死亡。物理方法的优点在于这种方法通常很便宜，无化学药剂污染组织，执行完成度高，且仅需要很少的设备或不需要设备，快速；缺点在于对操作者的技术要求较高，如操作技术不佳，恐无法使动物迅速死亡，而导致动物的更大痛苦；不适用于保持动物头颈部完整的研究；在抓取和保定的时候可能导致动物紧张。从动物福利角度来说，在物种合理且麻醉合理（如需要）的情况下，物理方法是合适的安乐死方法，可以避免或减小动物死亡前所承受的不必要的疼痛和痛苦，但是对实施安乐死的人员感官刺激较大，需要加强实验者的心理培训；并且所有的物理方法均会产生创伤，对实验动物和操作人员都存在潜在的危险。

6. 安乐死方法推荐（Recommended method）

1）小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠

二氧化碳法。将实验动物放入二氧化碳麻醉箱，打开二氧化碳气阀，等动物逐渐丧失意识后，将二氧化碳浓度升至100%，动物呈现无意识状态，包括无掐指反射或肌张力缺失或无角膜反射（仅适用于大动物和兔），继续通气2min以确定动物死亡。

异氟烷麻醉后颈椎脱臼。该方法可以作为二氧化碳的替代方案。以3-5%浓度诱导麻醉，使动物迅速失去意识，之后对实验动物进行颈椎脱臼/开胸/放血安乐死。

注意事项

a对于特定品种的动物，宜采用二氧化碳进行安乐死。高压瓶装的二氧化碳是建议使用的设备，不推荐使用干冰或其他化学方法制造二氧化碳。

b动物装入容器内时，不可过度拥挤，且不可同时混入不同品种的动物。

c以低浓度诱导后转入高浓度，使动物迅速失去意识。当动物呈现死亡状态后再持续灌注气体至少数分钟，将动物从安乐死容器内取出前必须确认动物死亡。可在动物取出后，用其他方法（脱颈、开胸、放血）对动物进行死亡确认。

d如动物未死亡，则立即使用其他方法（如颈椎脱臼、断头、开胸）对动物进行安乐死。

e注意安全，需在通风良好场合进行。

f二氧化碳吸入可能会诱发动物肺水肿，可能会影响其后研究中对动物组织器官的利用。

2）家兔

家兔可用戊巴比妥钠注射法安乐死，静脉注射为首选给药途径，腹腔、胸腔、心内注射也可。使用静脉注射100mg/kg处死家兔，既人道又安全有效。也可用麻醉后注射氯化钾的方法安乐死，麻醉药物可根据实际选用戊巴比妥钠、陆眠宁、舒泰等，麻醉后耳缘静脉注射10%氯化钾5mL即可。

3）犬、猪、猴

一般采用麻醉后注射氯化钾的方法安乐死，麻醉药物可根据实际选用戊巴比妥钠、陆眠宁、舒泰等，麻醉后耳缘静脉或前肢静脉注射10%氯化钾0.5mL/kg体重即可。也可使用麻醉后大量放血致死，同样根据实际选用戊巴比妥钠、陆眠宁、舒泰等麻醉药物，麻醉后切开实验动物主要大动脉放血致心跳停止。

4)两栖动物、爬行动物、鱼类

两栖动物和鱼类适用于液氮低温冷冻或急速降温的方法，直到动物失去方向，停止鳃盖运动，再在低温下保持一定时间。除此外，最好再用其他药物如稀释的氯化钠或氯化钙溶液确认死亡。

5）动物胎儿和新生动物

啮齿类胎儿和其他哺乳动物一样，在子宫内是没有意识的，缺氧也不会引起反应，对孕鼠实施安乐死后，没有必要将胎儿取出再实施安乐死。晚成熟的幼小啮齿类动物（像大鼠和小鼠）必须与早成熟的幼小啮齿类动物（像豚鼠）区别对待。早成熟的幼小啮齿类动物应该与成年动物同等对待。

非吸入剂方法：参考成年啮齿类动物的应用。

吸入性麻醉剂方法：非易燃的挥发性麻醉药对子宫内的胎儿和新生的啮齿类动物都是有效的。新生的小鼠置于二氧化碳中可能需要50分钟才会死亡。应该提供充足暴露时间，或者在新生的胎儿对疼痛没有反应之后，再实施辅助方法。

物理方法：对于胎儿和晚成熟性的新生动物，逐渐降温是一种有条件的可接受的方法。由于冷的表面会引起组织损伤、可能会导致疼痛，动物不能直接接触冰或者预先冷却的表面。对于大于7日龄的动物不推荐逐渐降温法。小于5日龄的晚成熟性的新生儿还没有足够成熟的神经系统感知疼痛，它们可以在液氮中快速冷冻而死亡。断头术、颈椎脱臼也可用于新生动物的安乐死。

表一、苏州大学安乐死方法推荐